2001
2002
2003
2004
2005
2006
2007

Programma
Abstracts
Route

Lezingen
Posters

Abstracts van Lezingen

"NANDROLON" PROBLEMATIEK IN HET ALGEMEEN EN IN PORTUGAL IN HET BIJZONDER BESCHOUWD VANUIT EEN DOPINGLABORATIUM
Douwe de Boer
LADB, Instituto Nacional Desporto, Lissabon, Portugal

Wat velen zich niet beseffen is dat de "nandrolon" problematiek eigenlijk reeds een oud fenomeen is. Slechts de afgelopen tijd heeft het enorm veel aandacht gekregen vanwege de associatie met overtredingen van dopingreglementen door diverse bekende sport(st)ers. Met name de recent ontdekte lichaamseigen oorsprong van "nandrolon" heeft daarbij olie op het vuur gegooid. Zoals gebruikelijk ontvingen de dopinglaboratoria in een zulke situatie ontzettend veel kritiek vanuit de sportwereld.

Ingegaan zal worden op de historie en de mogelijke oorzaken van de "nandrolon" problematiek. De lichaamseigen oorsprong van "nandrolon" zal uiteraard niet onbesproken blijven. Lange tijd meende men in Portugal dat het een typisch buitenlands probleem was, maar het is sinds april dit jaar op relatief grote schaal opgedoken in de urine van Portugese sporters.

Hoewel er altijd gebieden zijn waar dopinglaboratoria in het algemeen en ook het Portugese laboratorium zich kunnen en moeten verbeteren, zal duidelijk worden dat de oplossing gezocht worden buiten de laboratoria en dat de sportwereld zich zelf ook een spiegel moet voorhouden.

ZAAK FRANK DE BOER: ADME EN KWANTITATIEVE BIOANALYSE ONDER DE LOEP
Maarten J. Blom
Xendo Laboratories B.V., Meditech Center, L.J. Zielstraweg 1, 9713 GX Groningen

Op 15 maart 2001 werd, na afloop van de UEFA-cup wedstrijd tussen Celta de Vigo en FC Barcelona, bij Frank de Boer, sterspeler bij Barcelona en recordinternational bij het Nederlands elftal, urine verzameld voor een dopingtest. Hij werd positief bevonden op het gebruik van nandrolon, na analyse van het A-deel van de verzamelde urine in het dopinglaboratorium in Lissabon. Contra-expertise van het B-deel van het monster in het IOC laboratorium in Lausanne leverde eveneens een positief resultaat op. Frank de Boer werd op 14 juni 2001 voor 12 maanden geschorst en zou aldus slechts de finale van het WK2002 in Japan en Korea kunnen spelen. Groepswedstrijden, achtste, kwart- en halve finales zouden nog binnen de schorsing vallen.
Dopinganalyses voor het testen op het gebruik van nandrolon zijn dusdanig complex, zoals blijkt uit onderstaande, dat ons inziens het verband tussen een positieve dopingtest en dopinggebruik niet zo rechtlijnig is. 
De absorptie, distributie, metabolisme en excretie (ADME) van nandrolon varieert sterk bij verschillende toedieningsvormen. Bij een positief nandrolon dopinggeval is feitelijk sprake van een overschrijding van een grenswaarde van een nandrolon metaboliet, te weten 19-norandrosteron (19-NA). Deze kan echter, naast uit endogene nandrolon, ontstaan uit andere prohormonen. Analytisch gezien kan onderscheid gemaakt worden tussen endogeen en exogeen 19-NA. Ook hierop zal verder worden ingegaan.
Als laatste zal kort worden stilgestaan bij het gebruik van voedingssupplementen en de mogelijke consequenties wanneer deze vervuild zijn met voorlopers van 19-NA.
Alle bevindingen zullen worden geschetst in het licht van het positief bevonden zijnde urinemonster van Frank de Boer.

ZAAK FRANK DE BOER : DE KWALITATIEVE ANALYSE ONDER DE LOEP
Rokus A. de Zeeuw
Afdeling Analytische Chemie en Toxicologie, Universitair Centrum voor Farmacie, 9713 AV Groningen 

Bij de dopinganalyse op nandrolon gebruik komen twee types analyse aan de orde: 
Kwalitatief: In de urine moet de aanwezigheid van de belangrijkste nandrolon metaboliet, 19-norandrosteron (19-NA, of korter NA), eenduidig worden aangetoond. Daarnaast wordt gekeken of in de urine ook de positionele isomeer 19-norethiocholanon (19-NE of NE) voorkomt. 
Kwantitatief: Indien a. positief uitvalt moet de NA concentratie in de urine groter zijn dan 2 ng/mL.

Een sporter is "positief" als zowel aan a. als aan b. wordt voldaan. In de zaak Frank de Boer, gecontroleerd na een UEFA Cup wedstrijd, werd zijn urine in eerste instantie positief bevonden op de punten a. en b. door het Dopinglaboratorium in Lissabon. De door de sporter aangevraagde contra-expertise (de z.g. B-analyse), werd daarop uitgevoerd in het dopinglaboratorium te Lausanne, in aanwezigheid van Dr. Jaap Wieling als expert voor de sporter. Ok het laboratorium in Lausanne beoordeelde de urine positief op de punten a. en b. Beide laboratoria hebben de IOC-erkenning en zijn tevens ISO/IEC 17025-gecertificeerd. 
Het analysepad ziet er als vogt uit: Na hydrolyse van de urine met glucuronidase en vloeistof-vloeistof extractie worden NA en NE gesilyleerd en vervolgens geanalyseerd met GC-MS voor de kwantitaieve analyse en met GC-MS/MS voor de kwalitatieve analyse. In de voordracht zal vooral worden ingegaan op de kwalitatieve analyse en de eisen die het IOC stelt m.b.t. eenduidig vaststellen van de aanwezigheid van NA. Dit ter beantwoording van de vraag: Was Frank de Boer positief of niet ?

ROL VAN DE ADVOCATUUR EN HUN KIJK OP BIOANALYSE BIJ DOPING
Cor Hellingman (advocaat van Frank de Boer in de UEFA dopingzaak)
Hellingman Bunders Advocaten te Amsterdam

Elke beslissing in een geschil staat of valt met bewijs. In dopingzaken wordt de kwaliteit van de dopingtest doorgaans niet ter discussie gesteld, anders dan ten aanzien van mogelijke beïnvloeding van de te testen materie (fraude). Het sanctioneringsysteem richt zich op de vraag of bewezen is dat de stof in het lichaam is aangetroffen en of de hoeveelheid boven een bepaalde grenswaarde is geconstateerd. Het bewijs dat de urine "positief" is, dient verder te gaan dan enkel het "aannemelijk maken" van de aanwezigheid. Anderzijds is het voor de verdediging voldoende om aannemelijk te maken dat de urine "niet negatief" is. Daar zal de strategie van de verdediging steeds op gericht zijn.
De atleet krijgt slechts de kans om een confirmatie (contra expertise) bij te wonen. Daarmee lijkt de atleet in zijn verdediging te worden geschaad, nu hem het gehele onderzoek wordt onthouden. Bovendien wijzen ervaringsregels uit dat confirmatie (zoekt en gij zult vinden) eerder tot bevestiging dan tot ontkenning leidt. De enige bescherming die de atleet ten aanzien van het onderzoek heeft is gelegen in een correcte, transparante en volledige verantwoording in overeenstemming met de voorgeschreven ISO en ILAC regels, op grond waarvan de conclusie "positief" kan worden gebaseerd.

DE ONTWIKKELING VAN EEN ON-LINE PRECONCENTRATIE CZE SYSTEEM MET UV OF MS VOOR DE BIOANALYSE VAN THERAPEUTISCH ACTIEVE PEPTIDEN.
Dr. J.C.M. Waterval
N.V. Organon, Oss

Voor de kwantificering van lage concentraties therapeutisch actieve peptiden en eiwitten in lichaamsvloeistoffen zijn selectieve en gevoelige analytische methoden nodig. Capillaire electroforese is een geschikte scheidingsmethode voor peptiden en eiwitten, echter in de basisconfiguratie met UV detectie ontbreekt het de techniek aan de benodigde concentratiegevoeligheid.
Een grote verbetering van de concentratiegevoeligheid is verkregen door microliters monsteroplossing in het capillair te preconcentreren op een stationaire fase en het vervolgens in ongeveer 40 nanoliter te desorberen. Een effectieve ontzouting van de geïnjecteerde monsteroplossing vindt tegelijkertijd plaats door het spoelen van de stationaire fase met buffer. In combinatie met UV-detectie was voor twee modelpeptiden kwantificering mogelijk in lage nanomolaire gebied.
Een verdere verbetering van de concentratiegevoeligheid en de selectiviteit is verkregen door de combinatie met massaspectrometrie via een directe nano-electrospray interface zonder make-up flow. Een concentratiegevoeligheid in het lage picomolaire gebied is verkregen voor de modelpeptiden gonadoreline en angiotensine II. De resultaten met grotere peptiden, zoals insuline en cytochroom C tonen de brede toepasbaarheid van deze analytische methode aan.
Voor de analyse van de modelpeptiden in plasma was een off-line solid-phase extractie als monstervoorbewerking noodzakelijk. Verder waren between-run-wasstappen met SDS noodzakelijk voor regeneratie van de stationaire fase en de binnenkant van de capillairen.

METABOLOMICS: BIO-ANALYTISCHE STRATEGIEN 
Elwin Verheij, Albert Tas en Jan van der Greef
TNO Pharma, Postbus 360, 3700 AJ Zeist

Nu het genoom van uiteenlopende organismen, waaronder de mens, in kaart is gebracht, wordt inzicht in de interactie tussen genoom, transcriptoom, proteoom en metaboloom steeds belangrijker. Complexe relaties tussen deze informatie-lagen liggen op het terrein van de Bioinformatica. Wat betreft het metaboloom, het onderwerp van deze presentatie, zijn effectieve profileringsmethoden noodzakelijk om de grote variatie aan verbindingen kwalitatief en kwantatief te meten. LC-MS, GC-MS en NMR spelen daarbij een centrale rol. Profilering van lichaamsvloeistoffen en weefselextracten kan inzicht verschaffen in processen van ziekte en herstel en de werking van geneesmiddelen. 
Omdat profilering in veel gevallen op meerdere tijdpunten gedurende biochemische processen moet plaatsvinden (longitudinale analyse) ontstaan zeer omvangrijke data sets. De daarin aanwezige biochemische informatie kan op efficiënte wijze met behulp van multivariate analyse en display technieken aan de oppervlakte worden gebracht. Data analyse van LC-MS, GC-MS en NMR data is er met name op gericht deze complexe sets met elkaar te vergelijken en zodoende trends en verschillen in het voorkomen van metabolieten te ondekken. 
In deze lezing zal worden ingegaan op de (multivariate) analyse-strategieën die zijn ontwikkeld om grote aantallen LC-MS data files te analyseren. Bovendien zal worden besproken op welke wijze relaties tussen data sets, die met verschillende technieken zijn verkregen (bijvoorbeeld LC-MS en NMR), kunnen worden opgespoord. De aanpak zal worden geïllustreerd aan de hand van serum- en urine-metingen van transgene muizen met het humane APO-E3 Leiden gen.

SOLID-PHASE MICROEXTRACTION IN BIOANALYSIS.
Emile Koster
Spark Holland BV, P.O.Box 288, 7800 AJ Emmen, The Netherlands

One relatively new sample pretreatment approach in bioanalysis is solid-phase microextraction (SPME). In SPME analytes are passively transferred from a sample to an immobilized, supported liquid or solid. Extraction efficiency is determined by the passive partition of analytes between the sample matrix and the extraction phase. The evolution of the SPME in combination gas chromatography finds its origin in environmental analysis. About five years ago, hardly any research was performed on the applicability of SPME as a new sample pretreatment method for the determination of drugs in biological samples. As SPME proved to be easy-to-handle, the method also seemed to be very useful for on-site sampling at the bed of the patient in the future. 
The objective of the research described in this presentation is to demonstrate the potential of SPME in bioanalysis. For this briefly some background information about direct-immersion SPME is given. Systematic optimization of SPME is depicted in order to demonstrate the effects of sampling conditions, analyte properties and coating characteristics on the extraction performance. Furthermore, special methodologies are shown to reduce sample-handling time and to improve the sensitivity and selectivity of this extraction technique. Examples are shown to demonstrate that SPME can be used to determine drugs in biological samples.

ROBOTISERING IN DE BIOANALYSE: A BRAVE NEW WORLD?
Benno Ingelse
Janssen Research Foundation, Beerse, België

The need for fast bioanalytical methods within the pharmaceutical sector is rapidly growing. A lot of emphasis is put on lab automation. Especially sample preparation and clean-up time can be significantly reduced using either on-line techniques or automated off-line methods. Improved chromatographic techniques and the proliferation of LC-MS/MS have also enable us to speed up the analysis. This presentation will give an overview of different techniques that are used to increase sample throughput. Some automated/improved analytical methods that have been introduced in our laboratory will be discussed. The pitfalls and limitations of automation will also be reviewed.

Abstracts van Posters

MECHANISM OF ION FORMATION IN THE ATMOSPHERIC PRESSURE PHOTO-IONIZATION SOURCE
Grielof Koster and Andries P. Bruins
Rijksuniversiteit Groningen

In our lab an Atmospheric pressure photo-Ionization source (APPI) was developed as an interface between HPLC and mass spectrometers. The eluent from the HPLC is evaporated in a heated nebulizer and then irradiated with a 10 eV lamp to create ions in the vapor phase at atmospheric pressure. In order to make a more effective use of the irradiation of the lamp a dopant was introduced as an intermediate between the photons and the analyte:
dopant + hn ® dopant+o
dopant+o + analyte ® dopant + analyte+o 
However, instead of the expected analyte+o ion we very often get analyte.H+ ions.
What is the mechanism behind this? 
In the course of the reaction between toluene as a dopant and a solvent, the toluene molecular ion forms a cluster, preferably with three methanol or two acetonitril molecules. Next, the cluster ions can rearrange and fragment, either by loss of a hydrogen atom or by loss of a benzyl radical.
As a result, dopant ions are depleted and no longer available for ionization of analytes by charge transfer. Instead, protonated solvent clusters are present in high abundance and act as reactant ions for proton transfer to analytes.
Now that the role of solvent in proton transfer has become clear, conditions can be selected that favor charge transfer from dopant to analyte.
For this purpose we need solvents that cannot act as an intermediate for proton transfer.
Such solvents are straight phase eluents like
o  n-hexane 
o  dichloromethane
o  chloroform 
In experiments with these straight phase eluents we get a strong increase in signal for analytes ionized by charge transfer, such as polycyclic aromatics.
Final conclusion
- When proton accepting, reversed phase eluents are used, proton transfer to the analyte will take place via a protonated solvent cluster.
- Radical cation formation by charge transfer is favored in straight phase eluents that cannot accept a proton.

INTER-LABORATORY COMPARISON OF THE DETERMINATION OF DU127090 IN HUMAN PLASMA WITH LC-MS/MS
Peter van Amsterdam, Odylle Brockhoff, Anita van der Laan-Straathof en Leonie Leferink-van Schie
Solvay Pharmaceuticals, BioAnalysis Department, Weesp, Netherlands

An inter-laboratory comparison study of DU127090 in human plasma was conducted between Solvay Pharmaceuticals B.V. , Weesp, The Netherlands and three contract organizations (F, NL and US). The study was designed to establish the extent of agreement between the results obtained at the laboratories involved in the analysis of DU127090 study samples. This was done by comparing the results obtained by analyzing 40 inter-laboratory samples in duplicate by the four participating laboratories. Plasma samples were quantified for DU127090 using LC-MS/MS.
In the original method, the chemical analogue DU127045 was used as internal standard. Later on the octa-deuterated DU127090 was used as internal standard. In this study also the results found using both, the analogue and the d8, internal standards were compared.
Equivalence was assessed by comparing ratio of levels with the reference laboratory. The laboratories were regarded equivalent as the accuracy, expressed as difference of means, was not more than 15% and the precision, expressed as CV, was below 15%. Difference of means between the reference lab and the four test laboratories was in all cases less than 10%. The inter-day, intra-sample C.V. of the four participating laboratories was also < 10%.
The study also demonstrated the equivalence of both internal standards. Also the test laboratories showed equivalence among each other and to the reference laboratory.

A HIGHLY SENSITIVE ASSAY FOR DU127090 IN PLASMA USING HPLC WITH TANDEM MASS SPECTROMETRY
Dick van der Stel, Peter van Amsterdam, Anita van der Laan-Straathof en Leonie Leferink-van Schie HJC
Solvay Pharmaceuticals, BioAnalysis Department, Weesp, Netherlands

A bioanalytical method was developed to measure plasma levels of DU127090 in samples from clinical kinetic studies. This method, based upon HPLC with MS/MS detection made use of an chemical analogue as internal standard and suitable for the measurement of DU127090 plasma levels ranging from 0.02 - 20 ng/ml was validated on a Finnigan TSQ-700 with respect to system performance, absolute recovery, response function and the key validation parameters: accuracy, precision, sensitivity and specificity. The values for the validation parameters were established using data from reference solutions, calibration standards, quality control samples at three levels and blank plasma samples analyzed in five accepted validation batches. Data was processed using standard univariate statistics, ANOVA and regression analysis.
At a later instance when a deuterated internal standard became available and new mass spectrometer was purchased, a SCIEX API-365, the method was revalidated with focus on the performance. 
Both methods showed more or less equal performance characteristics and full filled the international criteria for bioanalytical method validation.

LC-APCI/MS/MS ANALYSIS OF RACTOPAMINE, A GROWTHY-PROMOTING AGENT, IN LIVESTOCK TISSUES.
Micromass Nederland

geen abstract ingediend

AUTOMATED MS AND MS/MS METABOLITE IDENTIFICATION OF S9MICROSOMALINCUBATIONS USING A MULTIPLEXED ELECTROSPRAY INTERFACE WITH A TRIPLEQUADRUPOLE
Micromass Nederland

geen abstract ingediend

RECENT DEVELOPMENTS IN ON-LINE SPE FOR HPLC AND LC-MS IN BIO-ANALYSIS.
Emile Koster and Bert Ooms
Spark Holland BV, P.O.Box 288, 7800 AJ Emmen, The Netherlands

On-line Solid Phase Extraction (SPE) is a well accepted technology in the bio-analytical laboratory for automated assays of drugs in biological samples [1]. Major merits include total automation, high precision and high sensitivity. With the ever increasing speed of analysis (Fast-LC, LC-MS/MS), the challenge for on-line SPE is to keep pace with the analytical run time to avoid waiting time for costly analyzers such as LC-MS/MS. For total elimination of analyzer waiting time, on-line SPE must not only be faster than the LC (-MS) run, it should also run in parallel with the LC(-MS) run. 
Bio-analytical laboratories in the pharmaceutical industry, especially in drug analysis, are facing another major challenge: the increasing pressure to reduce assay development time for the rapidly growing number of drug candidates that enter the pre-clinical test phase. At the same time, more high quality assay's are required for drug candidates in subsequent clinical test phases, where large numbers of biological samples need to be analyzed according stringent FDA directives and regulations.
Recent developments in on-line SPE were focussed to meet those challenges and not without success. New instrumentation for on-line SPE-LC-MS has been designed to permit total SPE-LC-MS assay cycle times of less than a minute. Dedicated system configurations and strategies for rapid and smart method development have been developed with automated procedures to select the optimum of all SPE parameters, including the SPE temperature. Generic protocols for SPE and LC have been developed to provide "zero method development" for pre-clinical assay's or as a successful first step towards an optimized high quality method. Examples of high throughput SPE-LC-MS, generic SPE-LC-MS method and smart automated method development will be presented and discussed. 

[1]. Mike S. Lee and Edward H. Kerns, Mass Spectrometry Reviews, 1999, (18), 187-279

ON-LINE TEMPERATURE-ASSISTED SPE-LC-MS FOR FAST DETERMINATION OF SIROLIMUS IN BLOOD.
Emile Koster ¹, Bert Ooms ¹, Harm Niederlander ², Ad de Jong ²
1) Spark Holland BV, P.O.Box 288, 7800 AJ Emmen, The Netherlands
2) Groningen Centre for Drug Research, Groningen University, A. Deusinglaan 1, 9713 AV Groningen.

Solid Phase Extraction (SPE) coupled on-line to LC-MS is widely used in bioanalytical laboratories in the pharmaceutical industry. Important merits include total automation, high precision and high sensitivity. For high throuhgput on-line SPE-LC-MS, SPE must run in parallel with LC-MS and should keep pace with the LC-MS run to maintain the high throughput potential of LC-MS analysis. To that end we have investigated the use of temperature as a tool to increase both speed and performance of on-line SPE for fast SPE-LC-MS. The rapid determination of sirolimus (a new macrolide immunosuppressant) in blood by Temperature Assisted SPE-LC-MS (TASPE-LC-MS), demonstrates the potential of this novel approach.
A Prospekt system for on-line solid phase extraction was modified to accommodate an in-house designed SPE cartridge heater. The heater controls the cartridge temperature from ambient up to 90°C. LC-MS was performed with an HP 1050 LC system coupled to an API 2000 Mass spectrometer with ESI interface. LC-MS of sirolimus was used as described in the literature and on-line SPE was developed on a HySphere C18 cartridge. Spiked blood samples were mixed with zincsulphate and methanol for cell rupture and centrifuged for deproteination. The temperature of every individual stage of the SPE process (conditioning, sample loading, wash and elution) was optimized to provide maximum assay performance and speed!
A rapid on-line Solid Phase Extraction was achieved on a HySphere C18 cartridge with 8 µm particles. Recovery of sirolimus was 100% and carry-over was eliminated using 40% methanol in water for sample application and needle wash with methanol and 40% methanol in water mixture resp. Using single MS in single ion monitoring mode, we were able to determine sirolimus as its Na-adduct in blood down to 0.5 ng/ml with good linearity and precision for the entire therapeutic range. Ion-suppression in the elution window of sirolimus was checked with blank injections during sirolimus infusion and SPE-LC conditions were optimized to achieve zero suppression. 
A high temperature (80°C) during cartridge conditioning allowed faster conditioning of the sorbent prior to sample application. Also, a high temperature during desorption (by the LC mobile phase) resulted in significantly smaller desorption volumes and consequently in much better LC-MS efficiency and shorter SPE-LC-MS run time. Higher temperatures during sample application and subsequent wash are presently studied and are expected to reduce the required wash volume or to improve clean-up efficiency. A total TASPE-LC-MS cycle time of less than 3 minutes for routine determination of sirolimus in blood samples is expected to be feasible.